Особенность всей группы Holometabola — принципиальные различия в биологии личинки и имаго — у двукрылых проявляется крайне ярко. Основной питающейся стадией Diptera является личинка, которая зачастую обладает значительно большей продолжительностью жизни, чем имаго. Имаго же выполняют главным образом функции размножения и расселения (у многих двукрылых они совсем не питаются).
Взрослые двукрылые в основном обитают в воздушной среде, в то время как для личинок характерны гораздо более разнообразные местообитания. Так личинки могут жить в воде, в почве, в тканях растений, животных и т. д.
Водные личинки характерны в основном для примитивных семейств группы Nematocera. Обитать они могут в толще воды, в илистых отложениях или в тканях водных растений. Дыхательная функция осуществляется по-разному: одни поднимаются на поверхность; другие прогрызают стебли водных растений и используют воздухоносные пучки; третьи переходят к кожному дыханию.
Обитающие на растениях двукрылые крайне разнообразны по своему питанию. Только небольшое число видов двукрылых располагается на открытых частях растений. Среди них есть как хищники, питающиеся другими членистоногими, приуроченными к растениям (тлями, гусеницами, клещами), так и фитофаги. В основном личинки обитают внутри растений. Они могут быть первичными (поражают живые ткани) или вторичными (поселяются в отмирающих тканях растений) вредителями. Также среди двукрылых есть минёры, галлообразователи, обитатели ходов древесных насекомых. Последние могут быть не только хищниками, но и мицетофагами, и сапрофагами. Личинки-фитофаги, живущие в почве, иногда играют весьма значительную роль в образовании гумуса.
Отдельную биологическую группу личинок Diptera составляют обитатели шляпочных грибов. В основном это грибные комарики (сем. Mycetophilidae), реже — комары сем. Limoniidae и мухи сем. Helomyzidae, сем. Drosophilidae и др.
Также велико число видов двукрылых в составе разнородной группы, характеризующейся наличием личинок-сапробионтов. К этой группе относится большинство синантропов. Зачастую эти двукрылые являются распространителями различным желудочно-кишечных инфекций и гельминтозов.
Личинки двукрылых также могут быть паразитами беспозвоночных (в основном насекомых) и позвоночных (земноводных, птиц, млекопитающих) животных. Необходимо отметить, что некоторые массовые виды оводов, паразитирующие на копытных, нередко приносят существенный урон животноводству.
Имаго двукрылых являются обитателями воздушной среды. В пищу большинство из них употребляет нектар или пыльцу, однако также среди них встречаются хищники (неспецифичные) и кровососы (в основном млекопитающих, реже птиц и насекомых). Группа кровососущих двукрылых не является филогенетически единой: в её состав входят и некоторые семейства Nematocera (сем. Culicidae, сем. Ceratopogonidae, сем. Simuliidae), и примитивные Brachycera (сем. Tabanidae), и представители Cyclorrhapha (сем. Muscidae, сем. Hyppoboscidae и др.).